FITC-Lactate dehydrogenase，异硫氰酸荧光素符号乳酸脱氢酶的制作而成过程概括

FITC-Lactate Dehydrogenase（FITC-LDH）是通过异硫氰酸荧光素（Fluorescein Isothiocyanate, FITC）与乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase, LDH）蛋白共价偶联形成的荧光标记酶。乳酸脱氢酶为四聚体蛋白酶，单体分子量约36 kDa，具有 NADH/NAD⁺ 依赖的催化活性，可催化乳酸与丙酮酸之间的可逆转化。通过 FITC 偶联，LDH 获得绿色荧光信号（激发约495 nm，发射约520 nm），适用于分子示踪、酶动力学研究及蛋白相互作用分析，同时尽量保留其酶学活性。

1. 反应原理与偶联机制

FITC-LDH 的镶嵌体系结构 FITC 异硫氰酸基（–N=C=S）与核蛋白氨基的共价不起作用作用：

• LDH 的表面包含赖氨酸残基和 N 端伯胺，有所作为亲核位点。
• 异硫氰酸碳原子核受伯胺亲核攻，成型稳定可靠的氨基异硫氰酸酯键（thiourea）。
• 偶联表现在轻碱加载液中通过（基本上 pH 8–9），湿润要求下稳定蛋清的三维空间构象和化学活化位点删改。
• 利用控制 FITC 与 LDH 的摩尔如果作用准确时间，能够调高偶联密度，照顾荧光密度与酶抗逆性。

2. 合成步骤概述

1. 淀粉酶质盐溶液备制
• 进行高纯净度 LDH 血清（可来历于牛心或从组体现采集体系）。
• 容解于适当的加载液（如碳酸盐加载液或聚磷酸盐加载液，pH 8.0–8.5），保证核蛋白浓硫酸浓度相对来说（通常 1–5 mg/mL）。
• 加载液中要加入极少量盐以维护球蛋白构象增强，互相逃避恶劣阴离子比强度造成的聚众。
2. FITC 饱和溶液需要准备
• FITC 基本上可溶性高，溶于水的于干燥处理的 DMSO 或无水乙醇中，养成高渗透压储备库液（约1–10 mg/mL）。
• 以免太阳光和湿冷周围环境，严防荧光团被氧化或蛋白质水解。
3. 偶联不良反应
• 将 FITC 产出液较慢放入 LDH 蛋清氢氧化钠溶液中，往往 FITC/蛋清摩尔之比1:1至5:1，可随着检测消费需求优化网络。
• 在轻酸碱性因素下（pH 8–9），温度或偏低温（20–25°C）发生反应 2–6 小时候。
• 轻快搅伴，减少小气泡或超强震荡，要确保球蛋白叠折稳定的性。
4. 中断发应与进行解决
• 偶联想法顺利完成后，可以用相应响应液做好稀释工作装修标准，并经过 pH 调整或下载小原子胺（如甘氨酸）全封闭式未想法的 FITC 异硫氰酸基。
• 此步骤之一杜绝游离态 FITC 对后期工作存在影响，一起要保持核蛋白功能模块。
5. 纯化与出掉悬浮 FITC
• 透析：安全使用碳原子结构量截掉膜（MWCO 10–30 kDa）彻底清除徘徊 FITC 和小碳原子结构副产品。
• 凝胶的作用过滤水（GFC）：顺利通过团伙筛柱分开 FITC-LDH 与低团伙量物。
• 效率高效液相色谱（HPLC）：可在还要高饱和度结果的情形下安全使用反相或亲水相柱隔离。
• 经常使用做法包涵：
• 纯化完整后，自身 FITC-LDH 并慢慢地果汁，店铺在响应液中，温度阴凉存有。

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