Ab-PROTAC偶联物是将PROTAC采用性递运至指定癌癌生殖细胞核的一些的办法。表面抗原-**偶联物（ADC）行将毒素特异形地传达给**癌癌生殖细胞核，多方面较减小毒副能力。ADC还行开展曲妥珠单抗（Herceptin）或培妥珠单抗（Perjeta）等单克隆表面抗原的，当然原因ADC自身的优越性性（列举被非靶向疗法癌癌生殖细胞核摄取量），**也只有众多ADC提升FDA获批。ADC发展进步面对的一般挑战自我与用量受限性毒素（DLT）关与，即功能主治与脱靶毒素范围内无发不平衡量。ADC的另一个说的是个短处是事实传达到中的**用量通常很少，这意思着**氧分子需要还极具**的癌癌生殖细胞核毒素，这很有也许 会以至于毒副能力。原因PROTAC还极具离子液体性随之较低用量便可生物降解工作目标蛋清，往往PROTAC很有也许 是ADC的抱负电机负载。
灵活运用曲妥珠单抗-PROTAC偶联物不错达成PROTAC的组织结构会暂时性递送，并在HER2阳性反应人体細胞核中会暂时性溶解任务蛋白质。偶联物将特女性朋友配合HER2/neu蛋白激酶，建立内吞进去人体細胞核后被溶酶体进行分解缓解压力出活力PROTAC（见图1A）。长期以来BRD4是真菌感染和**症的隐藏靶标，探秘了****人体細胞核绘图中灵活运用曲妥珠单抗和PROTAC偶联物达成特女性朋友人体細胞核类形中BRD4溶解的升值空间。
本文**选择BRD4降解剂MZ1的类似物PROTAC 1进行概念验证研究（图1B）。据报道100 nM MZ1处理细胞4小时后便可实现BRD4的完全降解，这种类型的PROTAC由BET的配体JQ1和VHL的配体组成。
**制订了通过叠氮和炔的环加成反应将PROTAC和曲妥珠单抗偶联的策略。利用化合物1的VHL配体部分上的游离羟基来结合叠氮端的PEG生成叠氮功能化的PROTAC，该羟基对于VHL的结合不可或缺，因此结合将PROTAC活性直到被溶酶体水解后才能生成活性的PROTAC。之后还原曲妥珠单抗的二硫键并与化合物13反应生成炔基功能化的曲妥珠单抗并将反应物在pH 8.5缓冲液中孵育过夜使其水解为具有血清稳定性的马来酰胺酸，后通过炔基官能化的曲妥珠单抗和叠氮-PROTAC 2之间的反应获得具有可控载荷和具有血清稳定性的Ab-PROTAC 3偶联物，从而确保了偶联物仅可通过酯基的水解释放PROTAC。Ab-PROTAC 3偶联物的合成由于没有采用铜（I）催化而排除了铜（I）的副作用。LC-MS分析显示了偶联物的成功合成，ELISA证实了抗体结合后活性仍完全保留。此外作者还是发现Ab-PROTAC 3具有稳定性：在37摄氏度pH 7.4的PBS中孵育4小时后仍有98.8％均保持完整结构，在孵育24小时后结构完整的偶联物仍高达83.5％（见图1E）。
基于细胞系中HER2/neu受体和BRD4的表达水平（见图2A、2B）和在测试相同条件下细胞系中游离PROTAC 1降解BRD4的能力（图2C），研究者选择了两种HER2阴性****细胞系（MCF-7和MDA-MB-231）和两种HER2阳性****细胞系（SK-BR-3和BT-474）来检测Ab-PROTAC 3的生物学活性。HER2 +和HER2-表型中，PROTAC 1对BRD4的降解差异性可能与细胞系中BRD4的表达差异有关。每种细胞系均用PBS、抗体（曲妥珠单抗）或阳性对照4（图2E）或不同浓度的Ab-PROTAC 3处理，并将BRD4降解剂4对BRD4的降解量作为阳性对照。认识到Ab-PROTAC 3在生理pH下稳定，作者在无血清培养基中用Ab-PROTAC 3处理细胞4小时或在处理1小时后将偶联物除去再培养23小时。
WB概述（图2D）得出结论Ab-PROTAC 3仅选用性化学生物化学溶解HER2+上皮細胞中的BRD4，而对HER2-上皮細胞中的BRD4无直接影响。用100 nM Ab-PROTAC 3治疗上皮細胞4 h，仅在HER2+上皮細胞系中仔细分析等到BRD4的完整化学生物化学溶解（50 nM也仔细分析到BRD4看起来化学生物化学溶解），而在其它测试图片质量浓度下HER2-上皮細胞系均未仔细分析到化学生物化学溶解。还有，用Ab-PROTAC 3治疗HER2+上皮細胞1分钟后祛除Ab-PROTAC 3随时孵育23分钟也仔细分析等到BRD4的看起来化学生物化学溶解，这得出结论偶联物在1分钟的期后已加以打开到HER2+上皮細胞中并被溶酶体分离制造了标准容量的PROTAC 1。在Ab-PROTAC 3对短缺HER2/neu多巴胺受体从表面的上皮細胞不许实行HER2/neu介导的内化，由于都没有仔细分析到化学生物化学溶解。可能重视，会用曲妥珠单抗治疗上皮細胞的其它科学测试下表中未仔细分析到BRD4化学生物化学溶解。这样科学测试效果单位证明了HER2/neu介导的抗原-PROTAC偶联物能选用性传达着PROTAC。
下面来，进第一步探索Ab-PROTAC 3能不能选择蛋清酶酶酶体诱发BRD4可降解塑料，在选择/不选择蛋清酶酶酶体剂硼替佐米（BTZ）的情况下下，将上皮组织細胞与PBS、弱阳比对4或100 nM Ab-PROTAC 3孵育后将上皮组织細胞裂解，WB现示了蛋清酶酶酶体剂可阻挡不同HER2+上皮组织細胞系中Ab-PROTAC 3介导的BRD4可降解塑料（图2F）。
多巴胺感觉介导的免疫抗原内化已根本多种策略来了范围广剖析，中间包括射线标签符号、荧光电子高倍显微镜、普鲁士蓝染色細胞术或細胞毒素测得。中间，用到荧光标签符号免疫抗原的共焦点电子高倍显微镜不错对免疫抗原在多种細胞区室（列举内体或溶酶体）来市场定位系统。原本有剖析曝光用到此种策略知道曲妥珠单抗的内化和細胞内区室化，证明格式HER2/曲妥珠单抗黏结物的内内化。注意到这类先例，我意在根本共焦点电子高倍显微镜剖析活細胞中Ab-PROTAC 3的运载，以根本内化齐头并进一歩剖析根据物在細胞内区域环境中的实际情形。对于那些这类剖析，用来到了荧光标签符号的AlexaFluor488-Ab-PROTAC（AF488-3），将HER2 + SK-BR-3細胞与100 nM AF488-3孵育1天内后洗衣机清洗細胞，并在1、4、8和24天内的时长显像以剖析黏结物的运载（见图3A）。1 h时在細胞外壁查看到AF488-3，而在孵育4 h后AF488-3就部位进来到多种的細胞内，大致是中级考试和次级内体（图3A和3C）。8天内后AF488标签符号的区室与溶酶体范围广共市场定位系统（图3A和3C）；在找不到将根据物过柱的实际情形下也查看来到了一样的效果。溶酶体消化系统Ab-PROTAC 3后须解放徘徊的活力性PROTAC 1，然后呢进来細胞核以可以闪避BRD4化学化学降解。在相当必备条件下展现**情况的HER2多巴胺感觉的MCF-7細胞無法摄入AF488-3（图3B），这与这类細胞的BED4没法被Ab-PROTAC诱骗化学化学降解一致性。
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